您好!欢迎访问ZSCI官方网站
国家自然科学基金标书
[热点推荐]

细胞代传和冻存的操作与注意事项

Meta分析的九个重要步骤

天津大学获批创办全国首个智能方向医学类本科专业

SCI论文翻译低质量?可能是遗漏了这几点!

诺贝尔医学奖得主:干细胞领域是医学突破口!

TUNLE染色实用指南
2018-03-28    来源:ZSCI公众号

TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口,产生一系列3’-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下,将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端,从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

▼ 实验步骤

1.充分脱蜡和水化

脱蜡可以先 60ºC 20 min,再用使用二甲苯两次 5-10 min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀;


2.把握好细胞通透的时间

一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用 10-30 min,几 μm 切片用短时间;几十 μm 切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。


3.适当延长 TUNEL 反应液的时间

一般是37ºC 1 h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至 2 h,但要结合你最终的背景着色。 



4.DAB显色条件的选择


一般 DAB 反应10 min 左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过 30 min;



5.PBS的充分清洗


在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达 5 次,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。



6.内源性POD的封闭也十分关键


对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。



▼注意事项

1.一定要设立阳性和阴性细胞对照。


2.阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松(1 μM)处理3-4 h的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。


3.阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同。


4.复染的目的是为了衬托组织形态结构,以利于结果分析,石蜡切片常用苏木素,核染成兰色,冷冻切片常用甲基绿,核染成绿色。


5.PBS 用蒸馏水、Na2HPO4、KH2PO4配制,现在有卖的,自己加蒸馏水稀释后即可用,很方便,也不贵。


6.蛋白酶 K 消化蛋白后,需要用封闭液。


7.TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。


8.如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。




【免费资料下载】

640.webp.jpg

0.jpg


更多实用内容,尽在ZSCI······

qrcode_for_gh_11ee914d2f00_430.jpg

扫描上方二维码关注【ZSCI】微信公众号,回复“技巧”即可获得更多更全的SCI资料!


联系我们
官方QQ群:706227459
官方网站:www.zsci.com.cn
服务邮箱:marketing@zsci.com.cn
客服QQ:1745693101
微信公众号
留言板

微信扫一扫
关注该公众号
400-808-9116