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5种应用广泛的医学实验技术
2018-07-04    来源:整理于网络

随着科技的发展,在我们科研过程中,可以使用的医学实验技术越来越多,这些技术在提升了我们最终实验结果的准确性方面起到了极大的作用,带动了基础研究和临床医学的发展,在此和我们来一起了解一下以下5种使用广泛的医学实验技术

 随着现代医学实验技术的飞速发展,越来越多新的医学技术也不断的印入我们眼帘,这些技术使我们面对疑难杂症不再束手无策,它们提高了病理诊断的准确性,并在研究发病机制、治疗方法上起了不可估量的作用,同时也带动了基础和临床医学的发展,使现代医学更加突飞猛进,下面我们就来了解一下几种应用广泛的医学实验技术。

 

1.免疫组织化学分析技术

 

免疫组织化学分析技术简称为免疫组化,是在组织化学的方法上加以免疫学分析而发展起来的一门新兴技术。其原理的核心是利用抗体抗原特异反应,使被化学标记的组织特异的显色或者发光,并可以通过借助荧光显微镜、电镜来进行观察分析。

免疫组化与其它的组织分析方法相比最大的优点即是特异性高,由于抗体抗原特异性强,抗体可以和组织细胞中的抗原直接结合,因此免疫组化从理论上来讲可以使我们仅仅只观察到想检测的细胞组织,因而排除了其它组织的干扰,大大增强了实验的准确性,例如白细胞共同抗原(LCA)可以特异的显示淋巴细胞成分。另一个优点是敏感性高,如果直接对细胞中某一组织进行染色观察,很可能由于组织过于微小导致信号微弱而检测不到,而通过免疫学的方法,以生物素显色或者过氧化物酶显色的方法进行检测,可以将信号放大成千上万倍,因而不管多么微小的反应都可以很轻松的观测到。

目前,免疫组化已经在多个医学领域被加以利用,例如确定肿瘤的分化程度、雌孕激素受体检测、癌基因蛋白的相关研究等等,免疫组化为提高病理程度的准确性,为病理诊断提供一个客观的指标做出了很大的贡献。

 

2.实时荧光定量PCR技术

 

实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术在1996年由美国Applies Biosystems公司推出后,凭借着其特异性强、灵敏度高、简单方便的特点,迅速在生物学各个领域内推广开来,如今已经成为现代分子生物学研究的重要工具。

Real-Time PCR技术是指在传统的PCR反应体系中加入荧光分子,通过监测荧光分子产生的荧光信号,来实时的反应整个PCR进程,并可以通过内参基因或者标准曲线,来定性或者定量的对未知模板进行研究分析。

由于Real-Time技术操作简便,实验结果准确,在医学领域内应用范围很广,包括mRNA的表达研究、DNA拷贝数检测、SNP测定等等。在肿瘤疾病的研究中发现,肿瘤常常伴随着某些关键性基因在特定位点产生易位或者突变,通过Real-Time可以快速有效的检测出基因突变,为调整肿瘤患者治疗方案、延长患者生命提供了帮助。在许多疾病反应中,不同类型的细胞会分泌分子量低的蛋白质,即细胞因子。通过Real-Time技术,对细胞因子的mRNA表达谱进行定量分析,对于阐明免疫性疾病,炎症反应等疾病的机理是很重要的。

 

3.基因敲除技术

 

基因敲除技术是以基因同源重组和胚胎干细胞技术为基础而发展起来的一种分子生物学技术。自1987年Thompasson首次建立起基因敲除小鼠模型以来,该技术已经得到迅猛的发展,为研究基因功能,推动生物学、医学的发展提供了新的方法。

在传统的基因敲除方法中,通过基因打靶的方法,将外源基因转染到细胞中,利用DNA的同源重组,使外源基因定点插入到基因组的特定位置,从而达到改变基因的目的,但是这种方法过于依赖细胞的随机重组,因此效率十分低下,大大增加了实验的困难程度。

现阶段,基因敲除技术已经有了新的方法。例如利用RNA干扰来引起基因沉默,RNA干扰(RNAi)是双链RNA分子在mRNA水平上引起的相关特异性的基因不表达。其具体原理是双链RNA分子会在Dicer酶的切割下形成siRNA,siRNA与相关酶结合形成诱导沉默复合物RISC,RISC会与siRNA特异性匹配的mRNA结合并引起降解,从而达到基因沉默的效果。

新一代的TALEN技术则被认为是基因敲除技术发展的里程碑,其设计原理是基于植物病原体黄单胞菌分泌的一种转录激活样效应因子TALE可以识别DNA序列的原理。TALE蛋白中的DNA结合域在特异位点打断目标基因,从而可以组装成特异结合任意DNA序列的模块,对DNA进行敲除。

2013年另外一种人工核酸内切酶CRISPR/Cas9的出现,使得对靶基因的操作更加简单方便。Cas9是由细菌和古细菌通过一种不断进化使用的免疫防御系统改造而成,Zhang等人分别在人293T细胞和小鼠NeroA细胞对EMX1和Th基因利用CRISPR/ Cas9系统完成了基因敲除。与其它的基因敲除技术相比,CRIPSR/Cas9使得基因敲除更加简单高效,甚至可以同时对多个基因进行敲除操作,使对靶基因的研究进入一片新的天空。

 

4.钙瞬变信号

 

钙离子作为细胞内的第二信使,广泛参与了各种细胞生命活动进程,而组织的病变,疾病的产生也必然影响细胞内的信号传递,导致钙信号的改变。目前,在对心脏疾病的研究中,深入理解钙瞬变信号,对心血管疾病的诊断具有重要意义。

在心脏中,钙瞬变信号的变化形式主要分为5种。钙火花,心肌细胞肌浆网上钙释放通道自发开放引起的局部钙释放事件;钙波,心肌细胞内钙负荷增高、胞内钙在局部增加并伴随着转导现象;钙震荡,细胞内钙浓度呈现一种反复变化的形式;钙星,单个LCC口处微区域内发生的钙瞬变;钙空穴,心室肌细胞中肌浆网出现低亲和性钙指示剂信号短暂变暗。

钙瞬变信号与心血管疾病有着密切关系,有研究报导他克莫司结合蛋白基因敲除小鼠会出现心肌肥大症状,同时钙瞬变的波动浮动会增加;在心力衰竭模型中,钙稳态会遭到破坏,进而影响了钙瞬变;病理情况下,心脏肌浆网释放的钙离子增多,使得心衰过程中心率失常的发生率增加。

目前实时监测钙信号的变化主要依赖于钙离子亲和性染料,例如Fura-2,Flur-4等,或者通过钙荧光蛋白,例如aequorin、obelin等,将钙离子浓度信号转化为荧光信号,再通过共聚焦显微镜来分析荧光信号的变化,侧面的反应钙浓度的变化。

 

5.高通量测序技术

 

1980年,英国生物化学家Sanger与美国生物化学家Gilbert建立起DNA测序技术,即“Sanger测序法”, 因此获得了诺贝尔化学奖。但是时至今日,Sanger测序法已经体现出自身的局限性,例如依赖于电泳分离技术,限制了对基因组测序的规模,另外该测序方法费用也十分昂贵,已经跟不上如今分子生物学的发展。

近年来,测序技术也是不断发展,涌现出许多新一代的测序方法,为了与最初的测序方法相区别,因此被称为“第二代测序法”,或者高通量测序。新的测序技术,使得一次性同时对几百万乃至上千万的序列测序成为可能,大大加速了生物学的研究进程。

高通量测序主要是将通用接头连接到被测序的片段化DNA上,通过不同的方法进行多次PCR反应,对每一步产生的信号进行检测,利用计算机分析获得完整的DNA序列信息。目前已经大规模商业化应用的高通量测序技术主要来自于Roche公司的454测序技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。

高通量测序技术由于具有传统测序不具备的精确、灵敏、快速、廉价等特征,因此在医学临床上应用十分广泛。在肿瘤学方面的研究中,高通量测序可以对其基因组序列测序,细致研究基因组拷贝数,基因相关性和多态性;高通量测序也可以用来筛查临床遗传疾病,例如检测孕妇血浆中胎儿的微量DNA,对胎儿进行产前检测;高通量测序对于病原微生物进行大规模的测序分析,获得大量的序列信息再分离出有用的缺陷型菌株;另外,高通量测序在例如DNA甲基化分析,肥厚型心肌病检测等疾病中也有广泛应用。


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